Laboratoriemetoder

I undervisningsforløbet DNA & liv, samt projektet DNA på FORKANT, er elever med til at indsamle og analysere miljøDNA-prøver vha. real time PCR-analyser. I DNA på FORKANT har eleverne også mulighed for at ekstrahere DNA'et fra den indsamlede miljøDNA-prøve. Det ekstraherede DNA bruges til selve real time PCR-analysen.

Her kan du læse mere om de forskellige laboratoriemetoder og finde ekstra materialer omkring teoretisk og praktisk brug af metoderne.

MiljøDNA

MiljøDNA er en betegnelse for DNA udvundet fra et bestemt miljø. Oftest bruges betegnelse eDNA (environmentalDNA) om samme begreb. MiljøDNA kan bruges til at påvise organismers tilstedeværelse på baggrund af deres DNA-spor, idet alle levende organismer udskiller DNA. MiljøDNA-metoden har været brugt til at undersøge mange forskellige miljøer heriblandt luft, jord, vand, is, sedimenter, husstøv og afføring.

Metoden bruges til at undersøge tilstedeværelse af organsimegrupper og endda adskille organismer til artsniveau. Dette gør metoden særdeles velegnet til brug i overvågning og kortlægning af arters udbredelse - særligt arter, som har et interessant fokus, bl.a. sjældne eller problematiske arter. En af metodens mange fordele er, at det kun er nødvendigt med en enkelt prøve fra det pågældende miljøsubstrat for at undersøge artens tilstedeværelse.

I projektet bag DNA & liv undersøges DNA-spor fra vandprøver. Vandprøverne filtreres igennem et Sterivex-filter, hvor en membran i filterenheden sørger for at tilbageholde celle- og DNA-materiale. Efter filtrering konserveres DNA'et med 96% ethanol inden senere DNA-ekstraktion.

Brug af miljøDNA

Niras - kortlægning af biodiversitet

Philip Francis Thomsen fra Aarhus universitet på Naturmødet 2022 - naturovervågning

DNA-ekstraktion

For at kunne arbejde videre med miljøDNA-prøven er det nødvendigt at udtrække det indsamlede DNA, som er bundet i filtermembranen. Dette gøres ved en DNA-ekstraktion eller DNA-opresning, hvor filtermembranen behandles med reagenser der lyserer cellerne og frigør dem fra membranen. Samtidig tilsætte en protease der hjælper med frigøre og stabilere DNAet, så det ikke bliver nedbrudt af forskellige nukleaser eller lignende enzymer.

Væsken, der er en blanding af cellerester, DNA, proteiner og andre kemiske komponenter, skal oprenses således at DNA-prøven bliver så ren som mulig. Dette gøres typisk vha. en række kromatografiske trin, hvor væsken filtreres og en membran der kan binde og frigøre DNA afhængig af det kemsike miljø.

Forsøgsvejledning til DNA-ekstraktion

Videnskabsklubben

Biotech Academy

Nucleus

Real time PCR-analyse

Real time PCR bygger på principperne fra normal PCR. Der laves en en blanding af reagenser som skal bruges i selve reaktionen. Denne blanding kaldes en mastermix, og består af primer, probe, Taq Polymerase, nukelotider, buffer og vand. I undersøgelser, hvor der ledes efter DNA-spor fra specifikke arter bruges primer og prober som er specifikt designet til, kun at reagere med den pågældende arts DNA.

Mastermixen tilsættes til de DNA-prøver man vil undersøge. I dette tilfælde tilsætte mastermix til miljøDNA-prøven. Derudover tilsættes mastermix og til to andre prøvetyper - en positiv kontrolprøve og en negativkontrolprøve. Den positive kontrolprøve indeholder ekstraheret væv fra på dengældende art, mens den negative kontrolprøve blot indeholder vand.